PROJET IntraCISH-LTγδ

Cibler et identifier les protéines inhibitrices intracellulaires de signalisation des lymphocytes cytotoxiques T gd pour un bénéfice en immunothérapie

Ce projet est porté par l’Institut Paoli-Calmettes – Centre de Recherche en Cancérologie

CONTEXTE

Les immunothérapies révolutionnent le traitement de certains cancers en ciblant principalement les lymphocytes T CD8+ αβ. Cependant, des patients restent réfractaires à ces traitements. Ainsi, de nouvelles approches thérapeutiques et l’utilisation de nouvelles cellules cytotoxiques sont évaluées en immuno-oncologie telles que la manipulation des lymphocytes T γδ (Waldman et al. Nat Rev Drug Discov 2020). Ces cellules représentent la population immunitaire offrant le pronostic le plus favorable en cas d’infiltration intra-tumorale sur un panel de 25 types de cancers différents (Gentles et al., Nat. Med. 2015).

Ce projet s’inscrit dans le développement par l’équipe d’un nouveau type d’immunothérapie intracellulaire ciblant des molécules inhibitrices de signalisation, telle que CISH (Cytokine-inducible SH2- containing protein).  L’équipe a montré que la modulation génétique de CISH favorise les fonctions anti-tumorales des lymphocytes T CD8+ et des cellules Natural Killer (NK) (Palmer*, Guittard* et al., J. Exp. Med, 2015 ; Bernard et al., JITC, 2022). Ces études ont permis la mise en place d’essais cliniques de phase I/II (NCT04426669 / NCT05566223). Nous envisageons de cibler CISH dans les cellules T γδ comme preuve de concept, puis d’identifier de nouvelles cibles intracellulaires dans ces cellules, par un criblage via CRISPR-Cas9 du génome entier.

OBJECTIFS

Les objectifs spécifiques de recherche sont d’identifier de nouvelles cibles dans les cellules T γδ par criblage CRISPR, puis de modifier génétiquement les cellules T γδ humaines et de déterminer les effets fonctionnels in vitro et in vivo. Ce projet sera réalisé en collaboration avec Le Dr. Sandrine Roulland (experte en criblage CRISPR/Cas9 ; CIML, Marseille) et Els Verhoyen (experte en transduction virale ; C3M, Nice).

Les objectifs spécifiques du projet sont les suivants :

• I. Comprendre et cibler la protéine intracellulaire inhibitrice CISH dans les lymphocytes T γδ

1.1       Déterminer l’expression de la protéine CISH dans les cellules T γδ humaines

1.2       Invalider le gène CISH dans les cellules T γδ humaines (CRISPR-Cas9)

1.3       Evaluer la fonctionnalité et la cytotoxicité des cellules T γδ humaines invalidées pour CISH

• II. Cribler et identifier de nouvelles protéines favorisant l’activité anti-tumorale des lymphocytes T γδ  

2.1       Identifier de nouvelles cibles γδ par screening CRISPR library

2.2       Déterminer les effets fonctionnels in vitro des cibles identifiées

2.3       Déterminer les effets fonctionnels in vivo en utilisant des PDX

RÉSULTATS

Nous avons tout d’abord mis en place un protocole d’expansion des cellules T γδ humaines primaires à partir de cellules du sang périphérique. Puis, nous avons montré par immuno-blot que la protéine intracellulaire CISH est exprimée après diverses stimulations IL-2, IL-15, NKG2D et par le TCR dans les cellules T Vγ9Vδ2 amplifiées. Nous développons actuellement une méthode de ciblage non virale pour cibler CISH pour insérer les RNPs (CAS9 + SgRNA CISH). Nos résultats préliminaires montrent une efficacité prometteuse dans des lignées T et NK pour le ciblage de CISH.  Enfin, pour la partie crible, nous avons produit une banque de sgRNA dans un type de lentivirus à enveloppe spécifique BAEV efficace pour transduire des T γδ. L’utilisation de cette banque en parallèle de la protéine CAS9 avec le peptide d’intérêt est actuellement testée sur lignées cellulaires puis sur cellules T γδ primaires.

VERBATIM

“Le projet s’inscrit dans le développement de stratégies visant à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques en immunothérapies des cancers. L’innovation dans ce projet réside à s’intéresser à des points de contrôle intracellulaires dans un type de lymphocytes cytotoxiques à l’interface des réponses immunes innée et adaptative : les cellules T γδ. Le point de contrôle de référence est la molécule intracellulaire CISH (Cytokine-inducible SH2- containing protein). Les objectifs spécifiques du projet sont de Comprendre et cibler la protéine intracellulaire inhibitrice CISH dans les lymphocytes T γδ et de Cribler et identifier de nouvelles protéines favorisant l’activité anti-tumorale des lymphocytes T γδ.”

PUBLICATIONS RÉCENTES

Publications 2022 -2023 sélectionnées :

Légende : Co-premier auteur *, auteur correspondant ¶, dernier auteur †.

Demerlé C, Gorvel L, Mello M, Pastor S, Degos C, Zarubica A, Angelis F, Fiore F, Nunes JA, Malissen B, Greillier L, Guittard G¶, Luche H, Barlesi F, Olive D. Anti-HVEM mAb therapy improves antitumoral immunity both in vitro and in vivo, in a novel transgenic mouse model expressing human HVEM and BTLA molecules challenged with HVEM expressing tumors. J Immunother Cancer. 2023 May;11(5):e006348. doi: 10.1136/jitc-2022-006348.

Laletin V, Bernard PL, Costa da Silva C, Guittard G¶, Nunes JA. Negative intracellular regulators of T-cell receptor (TCR) signaling as potential antitumor immunotherapy targets. J Immunother Cancer. 2023 May;11(5):e005845. doi: 10.1136/jitc-2022-005845.

Pastor S, Wicinski J, Charafe-Jauffret E, Verhoeyen E, Guittard G¶†, Ginestier C. Production of CRISPRi-engineered primary human mammary epithelial cells with baboon envelope pseudotyped lentiviral vectors. STAR Protoc. 2023 Jan 19;4(1):102055. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102055. Online ahead of print.

Bernard PL, Delconte R, Pastor S, Laletin V, Costa Da Silva C, Goubard A, Josselin E, Castellano R, Krug A, Vernerey J, Devillier R, Olive D, Verhoeyen E, Vivier E, Huntington ND, Nunes J, Guittard G¶†. Targeting CISH enhances natural cytotoxicity receptor signaling and reduces NK cell exhaustion to improve solid tumor immunity. J Immunother Cancer. 2022 May;10(5):e004244.